Tạo ra một GMO là một quá trình gồm nhiều bước. Các kỹ sư di truyền trước tiên phải chọn loại gen mà họ muốn đưa vào sinh vật. Điều này được thúc đẩy bởi những gì mục đích là cho sinh vật kết quả và được xây dựng trên nghiên cứu trước đó. Màn hình di truyền có thể được thực hiện để xác định các gen tiềm năng và các xét nghiệm sâu hơn sau đó được sử dụng để xác định các ứng cử viên tốt nhất. Sự phát triển của microarrays, phiên mã và giải trình tự bộ gen đã giúp việc tìm kiếm các gen phù hợp trở nên dễ dàng hơn nhiều.[50] May mắn cũng đóng một phần của nó; gen sẵn sàng làm tròn được phát hiện sau khi các nhà khoa học nhận thấy một loại vi khuẩn phát triển mạnh khi có thuốc diệt cỏ.[51]

Phân lập gen và nhân bản

Bước tiếp theo là phân lập gen ứng viên. Tế bào chứa gen được mở ra và DNA được tinh sạch.[52] Gen được tách ra bằng cách sử dụng các enzym giới hạn để cắt ADN thành các đoạn [53] hoặc phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để khuếch đại đoạn gen.[54] Các phân đoạn này sau đó có thể được chiết xuất thông qua điện di trên gel. Nếu gen được chọn hoặc bộ gen của sinh vật hiến tặng đã được nghiên cứu kỹ lưỡng thì có thể đã có thể truy cập được từ thư viện di truyền. Nếu trình tự DNA được biết, nhưng không có bản sao của gen, nó cũng có thể được tổng hợp nhân tạo.[55] Một khi đã phân lập được gen được ligated vào một plasmid mà sau đó được đưa vào một loại vi khuẩn. Plasmid được sao chép khi vi khuẩn phân chia, đảm bảo có sẵn các bản sao không giới hạn của gen.[56]

Trước khi gen được đưa vào sinh vật mục tiêu, nó phải được kết hợp với các yếu tố di truyền khác. Chúng bao gồm vùng khởi động và vùng kết thúc, khởi đầu và kết thúc phiên mã. Một gen đánh dấu có thể lựa chọn được thêm vào, trong hầu hết các trường hợp, gen này tạo ra khả năng kháng thuốc kháng sinh, vì vậy các nhà nghiên cứu có thể dễ dàng xác định tế bào nào đã được biến nạp thành công. Gen cũng có thể được sửa đổi ở giai đoạn này để biểu hiện hoặc hiệu quả tốt hơn. Những thao tác này được thực hiện bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp, chẳng hạn như tiêu hóa giới hạn, nối và nhân bản phân tử.[57]

Chèn DNA vào bộ gen vật chủ

Có một số kỹ thuật được sử dụng để chèn vật liệu di truyền vào bộ gen của vật chủ. Một số vi khuẩn có thể tiếp nhận DNA ngoại lai một cách tự nhiên. Khả năng này có thể được tạo ra ở các vi khuẩn khác thông qua căng thẳng (ví dụ như sốc nhiệt hoặc điện), làm tăng tính thấm của màng tế bào đối với DNA; DNA bổ sung có thể tích hợp với bộ gen hoặc tồn tại dưới dạng DNA ngoài nhiễm sắc thể. DNA thường được đưa vào tế bào động vật bằng cách sử dụng vi tiêm, nơi nó có thể được tiêm trực tiếp qua vỏ nhân của tế bào vào nhân hoặc thông qua việc sử dụng các vectơ virut.[58]

Bộ gen thực vật có thể được thiết kế bằng các phương pháp vật lý hoặc bằng cách sử dụng vi khuẩn Agrobacterium để phân phối các trình tự được lưu trữ trong vectơ nhị phân T-DNA. Ở thực vật, DNA thường được chèn bằng cách sử dụng phương pháp biến nạp qua Agrobacterium,[59] tận dụng trình tự T-DNA của vi khuẩn Agrobacterium cho phép đưa vật liệu di truyền vào tế bào thực vật một cách tự nhiên.[60] Các phương pháp khác bao gồm phương pháp sinh học, trong đó các hạt vàng hoặc vonfram được phủ bằng DNA và sau đó bắn vào các tế bào thực vật non,[61] và kết hợp điện, bao gồm sử dụng một cú sốc điện để làm cho màng tế bào có thể thẩm thấu DNA plasmid.

Vì chỉ có một tế bào được biến nạp vật chất di truyền, nên sinh vật phải được tái sinh từ tế bào đơn lẻ đó. Ở thực vật, điều này được thực hiện thông qua việc sử dụng nuôi cấy mô.[62][63] Ở động vật, cần đảm bảo rằng DNA được chèn vào có trong tế bào gốc phôi.[64] Vi khuẩn bao gồm một tế bào đơn lẻ và sinh sản vô tính nên việc tái tạo là không cần thiết. Các điểm đánh dấu có thể lựa chọn được sử dụng để dễ dàng phân biệt các tế bào đã biến đổi với các tế bào chưa được biến đổi. Những dấu hiệu này thường có trong sinh vật chuyển gen, mặc dù một số chiến lược đã được phát triển để có thể loại bỏ dấu hiệu có thể lựa chọn khỏi cây chuyển gen trưởng thành.[65]

Thử nghiệm thêm bằng cách sử dụng PCR, lai phương Nam và giải trình tự DNA được tiến hành để xác nhận rằng một sinh vật có chứa gen mới.[66] Các xét nghiệm này cũng có thể xác nhận vị trí nhiễm sắc thể và số lượng bản sao của gen được chèn vào. Sự hiện diện của gen không đảm bảo nó sẽ được biểu hiện ở các mức độ thích hợp trong mô đích, vì vậy các phương pháp tìm kiếm và đo lường các sản phẩm của gen (RNA và protein) cũng được sử dụng. Chúng bao gồm lai phía bắc, định lượng RT-PCR, Western blot, miễn dịch huỳnh quang, ELISA và phân tích kiểu hình.[67]

Vật liệu di truyền mới có thể được đưa vào ngẫu nhiên trong bộ gen của vật chủ hoặc được nhắm mục tiêu đến một vị trí cụ thể. Kỹ thuật nhắm mục tiêu gen sử dụng tái tổ hợp tương đồng để tạo ra những thay đổi mong muốn đối với một gen nội sinh cụ thể. Điều này có xu hướng xảy ra với tần suất tương đối thấp ở thực vật và động vật và thường yêu cầu sử dụng các dấu hiệu có thể lựa chọn. Tần suất nhắm mục tiêu gen có thể được tăng cường đáng kể thông qua chỉnh sửa bộ gen. Chỉnh sửa bộ gen sử dụng các nucleaza được thiết kế nhân tạo để tạo ra các đứt gãy sợi kép cụ thể tại các vị trí mong muốn trong bộ gen và sử dụng các cơ chế nội sinh của tế bào để sửa chữa sự đứt gãy do các quá trình tự nhiên của quá trình tái tổ hợp tương đồng và liên kết cuối không giống nhau. Có bốn họ nucleaza được thiết kế: meganucleaza,[68][69] nucleaza ngón tay kẽm,[70][71] nucleaza hiệu ứng giống chất hoạt hóa phiên mã (TALENs),[72][73] và hệ thống Cas9-guideRNA (đã điều chỉnh từ CRISPR).[74][75] TALEN và CRISPR là hai loại được sử dụng phổ biến nhất và mỗi loại đều có những ưu điểm riêng.[76] TALENs có độ đặc hiệu mục tiêu cao hơn, trong khi CRISPR dễ thiết kế hơn và hiệu quả hơn.[76] Ngoài việc tăng cường khả năng nhắm mục tiêu gen, các nucleaza đã được thiết kế có thể được sử dụng để tạo ra các đột biến tại các gen nội sinh tạo ra loại gen.[77][78]